هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.
1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector
2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12
3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector
4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39
5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector
6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین
7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C
8- سنجشهای ایمونولوژیک
باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:
باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالکی سویه
اشریشیالکی سویه BL21 – اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss
پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3
- جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:
برای تکثیر ج داسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.
مواد:
بافر TE:
Tris – Hel 10mm
EDTA 1.0mm
PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.
پروتئیناز K:
CTAB/NaCl:
Nacl 4.1gr
CTAB 10gr
DDW 100ml (Final Volume)
روش:
ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:
1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.
2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.
3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت 10 دققیق در 0C65 انکوبه می کنیم.
4- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.
5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.
6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می کنیم. پس از چند دقیقه DNA کروموزومی ته نشین شده که می توان بات یک پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.
7- رسوب DNA کروموزومی را با الکل 70% شستشو داده و پس از خشک شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.
بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی:
برای تعیین خلوط کروموزوم باکتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود.
1- بافر PBE pH=8(10X)
Tris – base 890mM
Boric Acid 890mM
EDTA 25mM
2- آگارز MP
3- تانک الکتروفورز افقی
روش:
ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بکمک حرارت حل کرده و ژل آگارز افقی را سینی مخصوص تانک الکتروفورز افقی تهیه می نمائیم. سپس به مقدار Ml5 از DNA کروموزومی را در چلهک ژل ساخته شده ریخته و در تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE(0.5x) پس از برقراری جریان الکتریکی مستقیم الکتروفورز می کنیم.
بریا تعیین مقدار DNA نیز پس از تهیه رقت تز کروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گیری می نمائیم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عکس رقت 50 DD قرائت شده = مقدار DNA تعیین می گردد.
- مرحله پس از جداسازی کروموزوم تکثیر و جداسازی ژنهای مورد نظر است. این فرآیند با استفاده از دستگاه PCR انجام می گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پایه ای، ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تک پلی مرآز Tag Polymerase تکثیر نمود. عوامل پایه ای ذکر شده شامل موارد ذیل است.
1- قالب
2- پرایمر جلو Forward
3- پرایمر عقب Revers
4- دروکسی نوکلئوتیدها LNTP
5- منیزیوم
6- بافر
7- آنزیم پلی مرآز
8- آب مقطر استریل
برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی کرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوکلئوتیدی ژنهای فوق را از مرکز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.
accession No(L7/L12). L27819
accession No(P39). L35038
سپس بر این اساس و درنظر گرفتن نکات استاندارد طراحی پرایمر از جمله طول پرایمر، دمای اتصال G+C%، تولید پرایمر، تولید لوپ یا حلقه و ... ترادف پرایمرهای تعیین میگردد. در این مرحله از آنالیزهای کامپیوتری توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده میگردد.
ترادف ژن مورد نظر و پرایمرهای Forward و Reverse برای جداسازی ژنهای فوق از باکتری بروسلا به شرح زیر است:
1- پرایمرهای L7/L12
Forward:
5’ GGA AAT GCT GAT CTC GCA AA3’
Revers:
5’ CCA CTT GAG TTC AAC XTT GGC CA3’
2- پرایمرهای P39
Forward:
5’ GCC GGC GCC TGT TGC CAA 3’
Reverse:
5’ C CGC TTT TGC GGC TTC AA 3’
جهت سهولت مراحل کلونینگ و با توجه به محلهای ممکن برای کلون سازی در پلاسمیدهای حد واسط و پلاسمیدهای بیانی دو جایگاه آنزیمی BamHI و XhoI درابتدا و انتهای پرایمر طراحی شده است. پرایمرهای طراحی شده توسط شرکت MWG آلمان ساخته شد.
برای انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. برای بهینه سازی تکثیر ژنهای ذکر شده غلظتهای مختلف یون منیزیم (از 5/1 تا 5/3 میلی مولار) و دماهای مختلف مناسب برای اتصال پرایمرها با DNA کروموزومی (66-63 درجه سانتیگراد) بکار رفته است.
- تائید ژنوم سنتز شده توسط PCR:
برای تایید صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزیمی ژنهای فوق استفاده می گردد. چنانچه از هضم آنزیمی ژن L7/L12 با آنزیمهای EC0RI و Hind III بترتیب قطعات (168+206) و (305+69) باید دیده شود و از هضم آنزیمی ژن P39 با آنزیمهای NEOL و Hind III بترتیب قطعات (136+560+709) و (553+652) باید دیده شود.
برای تایید نهایی صحت ژنهای تکثیر شده از نظر ماهیت و ترادف نوکلئوتیدی آنها، این ژنها ابتدا در ناقل pSK+ کلون گردید و سپس برای تعیین سکانس به شرکت مربوط ارسال گردید.
- کلونینگ ژنهای L7/L12 و P39 در کلونینگ pSK+:
برای کلونینگ ژنهای فوق ابتدا باید ژنها تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسمیدی pSK نیز با آنزیمهای اخیر برش داده شود.
1- برش آنزیمی ژنهای L7/L12 و P39 با آنزیمهای BamHI و xhoI.
2- برش آنزیمی پلاسمید pSK با آنزیمهای BamHI و xhoI پلاسمید pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. این پلاسمید دارای یک ناحیه تکثیری ColE1، یک ناحیه مقاومت به آمپی سیلین تحریک ناحیه f1 origin و یک ناحیه بنام multiple cloning site=MCS که جایگاه تعدادی از آنزیمهای تحدیدی را در خود دارد. برای تکثیز پلاسمید فوق از باکتری اشدیشیاکلی استفاده می گردد.
3- برای برش آنزیمی این پلاسمید ابتدا باکتری حاوی این پلاسمید را تکثیر میدهد. در ضمن تکثیر باکتری پلاسمید مورد نظر در باکتری همانندسازی کرده و تعداد آن افزایش می یابد. برای تکثیر باکتری از کشت آن در ml2 محیط LB حاوی ng/ml50 آنتی بیوتیک آمپی سیلین استفاده می شود. پس از 18 ساعت کشت مورد نظر کدورت مناسب را پیدا میکند. پس از آن پلاسمید از باکتری تخلیص میگردد.
مواد:
1- SET buffer:
Sucrose 50mM
EDTA 10mM
Tris-Hcl pH 8 15mM
2- بافر لیزکننده:
Lysis Buffer (1ml)
Na OH (2N) 100ml
SDS (10%) 100ml
DDW 800ml
3- استات پتاسیم 5 مولار با pH 4.2
Potassiun Acetate 5M for 100ml
KAC (4M) 60ml
Acetic Acid 11.5ml
DDW 28.5ml
روش:
ابتدا 5/1 میلی لیتر از کشت 18 ساعت باکتری را با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm4000 بمدت 5 دقیقه رسوب میدهیم. سپس رسوب بدست آمده را در 100ml از SET buffer کاملاً حل کرده بمدت 5 دقیقه در حرارت اتاق قرار می دهیم. پس از مدت فوق ml200 از محلول لیز بافر تازه تهیه شده را در رسوب سوسپانسیون فوق ریخته، بخوبی مخلوط کرده و بمدت 2 دقیقه در یخ قرار میدهیم. سپی ml150 از محلول KAC بر نخلوط فوق ریخته پس از مخلوط نمودن مجدداً بمدت 5 دقیقه در یخ میگذاریم.
جهت تفکیک پروتئینهای آزادشده سلولی از DNA پلاسمید ml450 از ترکیب فنل-کلروفرم – ایزوآمیل الکل (1/24/25) بر سوسپانسیون حاوی باکتریهای لیز شده افزوده و بمدت 5 دقیقه با دور rpm10000 سناتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را در لوله دیگر ریخته و به آن یک میلی لیتر اتانل مطلق سرد می افزرائیم. سپس با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm1000 بمدت 5 دقیقه DNA پلاسمیدی را رسوب میدهیم. DNA رسوب داده را با الکل 70% شستشو میدهیم. پس از خشک شدن رسوب در مجاورت هوا، در ml20 از بافر TE حل نموده و به آن ئم5 از آنزیم Rnase A(5mg/ml) برای حذف RNA موجود اضافه می کنیم و بمدت نیم ساعت در 0c37 قرار میدهیم. برای نگهداری پلاسمید از 0c20- استفاده میشود.
پس از تلخیص، پلاسمید از نظر کیفی و کمی سنجیده میشود. برای این منظور از روشی که قبلاً در مورد کروموزوم باکتری توضیح داده شد، استفاده میگردد.
- هضم آنزمی پلاسمید sPK:
پس از تعیین غلظت پلاسمیدهای خالص شده هضم آنزیمی آن با استفاده از آنزیمهای BamHI و xhoI صورت میگیرد.
pSK 5ml(10ng)
BamHI 1ml
xhoI 1ml
Baffer (y Lango) 2ml
DDW 21ml
Tota l 30ml
پس از مدت 2 ساعت انکوباسیون در دمای 0c37 برای اطمینان از غلظت و کیفیت نمونه هضم شده آنرا برروی ژل آگارز 8/0% بررسی می نمائیم.
- هضم آنزیمی ژنهای L7/L12 و P39:
ژنهای فوق را نیز نظیر پلامید pSK تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرار می دهیم.
L7/L12 10ml P39 10ml
BamHI 1ml BamHI 1ml
xhoI 1ml xhoI 1ml
Baffer 2ml Baffer 2ml
DDW 21 DDW 21
total 30 total 30
- اتصال ژنهای L7/L12 و P39 با پلاسمید (Ligation preparation) PSK برای اتصال قطعات ژنی با پلاسمید PSK از آنزیم T4 DNA Ligale استفاده می شود.
L7/L12 10ml P39 10ml
PSK 2ml PSK 2ml
T4 DNA ligale 1ml T4DNA ligale 1ml
Baffer 1.5ml Baffer 1.5ml
DDW 0.5ml DDW 0.5ml
total 15ml total 15ml
مخلوط فوق را بمدت 16 ساعت در 0c14 قرار میدهیم.
- انتقال DNA نوترکیب به میزبان) E0ch (HHI
- برای انتقال DNA نوترکیب به سلولهای میزبان ) E0ch (HHI ابتدا باید سلولهای میزبانهای مورد نظر و آماده پذیرش DNA نوتکریب بنمائیم. Competent cell برای تهیه این سلولها از وش زیر استفاده می گردد.
مواد:
محیط SOB
SOB for 100ml
0.5% yeast extract
2% trypton
10mm Nacl
2.5mm Kcl
10mm Mgcl2
10mm MgSo4
پس از تنظیم pH برروی 7-7.2 تنظیم کرده و پس از آن اتوکلاو می کنیم.
بافر TFBI
TFBI (for 100ml)
KAC 30mm
MnCl2.4H2O 50mm
Kcl 100mm
Cacl2.2H2O 10mm
Glycerol 15ml
H2O Complete to 100ml
PH را برروی 8/5 تنظیم کرده و پس از آن با اتوکلاو استریل می نمائیم.
بافر TFBII
TFB II (for 100ml)
MOPS 10mm
Cacl2.2H2O 75mm
KCL 10mm
Glycerol 15ml
H2O Complete to 100ml
پس از مخلوط نمودن آنرا با اتوکلاو استریل می کنیم.
روش تهیه Competent Cell
100 میلی لیتر از محیط SOB را در یک ارلن یک لیتری تهیه کرده و اتوکلاو می نمائیم. به محیط فوق 1 میلی لیتر از کشت 18 ساعت
) E.col.(DH5را تلقیح می نمائیم. ارلن را برروی شبکه قرار داده و با دور rpm200 در دمای 0C37 قرار داده تا OD550nm به حدود 5/0 برسد. ارلن محتوی باکتری را بمدت نیم ساعت در یخ قرار داده و پس از آن بندت 10 دقیقه در دمای 0C4 در rpm1800 سانتریفوژ می کنیم. برروی رسوب بدست آمده 20 /میلی لیتر بافر TFB I اضافه کرده و به آرامی رسوب را در بافر حل نموده و بمدت 10 دقیقه در یخ می گذاریم. سوسپانسیون فوق را بمدت 10 دقیقه در 0C4 با دور rpm1800 سانتریفوژ کرده و به رسوب بدست‌آمده 2 میلی لیتر بافر FTB II افزوده بمدت 15 دقیقه در یخ قرار می دهیم. پس از این مدت ml100 از سوسپانسیون باکتری را در ایندرف 5/1 ریخته و آنرا در 0C70 نگهداری می نمائیم.
ترانسفورماسیون
مواد لازم:
- سلولهای Competent
- پلاسمید DNA نوترکیبی
- محیط کشت مایع نوترین برات
- پلیت حاوی محیط کشت نوترین آگار به همراه آمپی سیلین
- گرمخانه 0C37
روش کار:
1- سلولهای Comptent باکتری ) E.coli.(DH5 را از 0C70- بیرون آورده روی یخ قرار می دهیم تا باز شود.
2- مقدار ml10 از مخلوط پلاسمید نوترکیب شده در مرحله قبل، را به سلولهای Competent می افزائیم.
3- نمونه فوق را بمدت 30 دقیقه در یخ قرار میدهیم.
4- پس از زمان فوق اپندرف حاوی نمونه را بلافاصله در گرمخانه 0C37 بمدت 5 دقیقه قرار میدهیم.
5- مجدداً نمونه ها را بمدت 2 دقیقه در یخ قرار میدهیم.
6- مقدار ml800 محیط کشت نوترین برات به نمونه فوق اضافه کرده و بمدت یکساعت در 0C37 انکوبه مب کنیم.
7- پس از انکوباسیون، سوسپانسیون فوق را به پلیتهای حاوی نوترین آگار (محتوی Ng/cl60 آمپی سیلین) منتقل کرده و پلیتها را 18 ساعت در گرمخانه 0C37 قرار می دهیم.
- غربالگری
باکتریهای رشد یافته پس از ترانسفورماسیون در محییط نوترین برات آنتی بیوتیک کشت داده و پس از حدود 18 ساعت که کدورت محیط مناسب شد، پلامیت آنها را تخلیص می کنیم. پلاسمیدهیا تخلیص شده را برروی ژل آگارز 1% بررسی می نمائیم. پلاسمیدهائی که حاوی ژن مورد نظر باشند، حرکت کنتری دارند لذا از سایر پلاسمیدهای فاقد ژن قابل شناسایی می باشند. پس از شناسایی این باکتریها با انجام PCR و هضم آنزیمی پلاسمید با آنزیمهای BamHI و xhoI مورد تایید قرار می گیرند بطوریکه در PCR قطعه مورد نظر دیده شود و در هضم آنزیمی از پلاسمید خارج شود.
- تعیین ترادف نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر:
پس از بدست آوردن کلون مو رد نظر، پلاسمیدها را پس از تخلیص برای تعیین ترداف نوکلئوتیدی به شرکت MWG ارسال نمودیم.
- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریوتی:
برای تولید پروتئین نوترکیب از ژنهای L7/L12 و P39 به سه جزء اصلی نیاز است:
1- ناقل بیان کننده expression vector
2- قطعه ژن مورد نظر
3- میزبان
1- ناقل بیان کننده:
در این تحقیق از دو ناقل بیانی استفاده شده است. برای بیان ژن L7/L12از ناقل PET2800 و برای بیان ژن P39 از ناقل PGEX4T1 استفاده شده است.
PRT2800 از شرکت Novageh است. خصوصیات این پلاسمید بقرار زیر است:
الف: این ناقل دارای پروموتور فاژ T7 می باشد که تحت کنترل اپراتور Lac میباشد.
ب: در این ناقل برای افزایش میزان توجه، جایگاه اتصال به ریبوزوم تهبیه شده است.
ج: ترادف ویژه مربوط به 6 اسید آمینه هیستیدین در ناحیه ‘5 مکان کلونینگ ژن قرذار گرفته است.
د: دراین ناقل ناحیه ویژه ای برای آنزیمهای تحدیدی برای وارد کردن ژن تعبیه شده است.
و: ژن مربوط به مقاومت به کانامایسین
هـ: دارای ترادف لازم برای همانندسازی پلاسمید
پلاسمید PGEX4T1 از شرکت فارماسیا یم باشد. خصوصیات این پلاسمید بقرار زیر است:
الف: این ناقل دارای پروموتور تریپتونان است که تحت کنترل اپراتور Lac می باشد.
ب: در این ناقل ربای افزایش میزان ترجمه، جایگاه اتصال به ریبوزوم تعبیه شده است.
ج: ترادف ویژه مربوط به آنزیم گلوتایتون S ترانفرآز که در ناحیه ‘5 مکان کلونینگ ژن قرار گرفته است.
د- در این ناقل ناحیه ویژه ای برای آنزیمهای تحدیدی جهت کلون نمودن ژن تعبیه شده است.
و- ژن مربوط به مقاومت آمپی سیلین
هـ - ترداف لازم برای همانندسازی پلاسمید.
- سویه E.coli میزبان: سویه های E.coli نظیر با دارا بودن پروتئازها باعث شکسته شدن پذوتئینهای نوترکیب می گردند. از این نظر برای تولید پروتئینهای نوترکیب از سویه هایی استفاده می شود که فاقد آنزیمها باشند. در این تحقیق برای بیان ژن در ناقل PET280 از سویه BL21(DE3)Plyss و برای بیان آن در ناقل PGEX4T1 از سویه BL21 استفاده میشود.
برای کلون نمودن ژنهای L7/L12 و P39 در ناقل بیان کننده مراحل زیر انجام می شود:
1- استخراج قطعه ژنهای مورد نظر از ناقل PSK
2- برش آنزیمی ناقلهای بیان کننده
3- اتصال دو قطعه DNA
4- انتقال DNA نوترکیب به میزان ) E.coli.(DH5
5- غربالگری
1- استخراج قطعه ژنهای مورد نظر از ناقل PSK
برای این منظور ابتدا باکتریهای حاوی کلونهای PSK-L7/L12 و
PSK-P39 را در محیط مایع نوترین برایت حای آنتی بیوتیک کشت داده و پس از تخلیص پلاسمید با کمک هضم آنزیمی با دو آنزیم BamHI و xhoI را انجام داده و قطعه ژنی بریده شده مورد نظر را از روی ژل خالص می کنیم که در اینجا در کیت Roche استفاده شده است.
مواد لازم:
- آنزیمهای BamHI و xhoI
- ژل آگارز 8/0% استخراج ژن
- محلولهای لازم برای تخلیص پلاسمید
روش کار:
1- در دو لوله حاوی 2 میلی لیتر از محیط نوترین برات حاوی آمپی سیلین از کلون حاوی PSK-L7/L12 و PSK-P39 تلقیح کرده و بمدت 18 ساعت در
0C37 انکوبه می نمائیم.
2- استخراج پلاسمیدها به روشی که قبلاً ذکر گردید.
3- هضم آنزیم پلاسمید با آنزیمهای BamHI و xhoI که بصورت زیر انجام میگردد:
PSK-L7/L12 5ml
BamHI 1ml
XhoHI 1ml
Baffer (y-tango) 4ml
DDW 9ml
Total 20ml
PSK-P39 5ml
BamHI 1ml
XhoHI 1ml
Baffer (y-tango) 4ml
DDW 9ml
Total 20ml
سپس بمدت 2 ساعت در 0C37 انکوبه می نمائیم.
4- ژل آگارز 1% را با چاهکهای بزرگ را تهیه کرده و سپس پلاسمیدهای هضم شده را در این چاهکها ریخته و در تانک افقی الکتروفورز می نمائیم. پس از الکتروفوروز، ژل را با اتیدیوم برماید رنگ آمیزی کرده و قطعه ژن های جدا شده از پلاسمید را با امواج V18 با طول موج بالا مشاهده و از روی ژل آگارز با تیغ اسکالیل برداشت میکنیم.
5- استخراج قطعه DNA از ژل آگارز با استفاده از کیت Roche کیت استخراج DNA طوری طراحی شده که تهیه و تخلیص DNA از روی ژلهای آگارز را بخوبی امکان پذیر میسازد و نیازی به تخلیص DNA با فنل و رسوب دادن آن با اتانل نمی باشد.
ذرات Silica بکار رفته در این کیت طوری بهینه شده است که قطعات خیلی کوچک DNA براحتی و با مقدار زیاد می توانند به این ذرات اتصال یابند و مجدداً آزاد گردند. در طی مرلحل شستشو دیگر اجزاء اسید نوکلئیک شامل آگارز پروتئینها و اتیدیوم برماید حذف خواهد شد. پس از استخراج DNA از ذرات Silica، DNA محلول در بافر TE و یا آب بدست آید.
روش کار:
قطعه برش بافته از آگارز حاوی ژن مورد نظر را وزن نموده و به ازای هر mg100 از ژل ml300 از بافر شماره 1 به ژل آگارز افزوده و به این مخلوط ml10 از Silica اضافه می نمائیم. پس از بهم زدن بمدت 15 دقیقه در 0C56 انکوبه کرده و در هر 2 تا 3 دقیقه بشدت مخلوط را بهم می زنیم.
نمونه را بمدت 30 ثانیه سانتریفوژ کرده و بدقت سیوپ رویی را جدا می کنیم رسوب را ml500 بافر شماره 2 شتستشو را
2- برش آنزیمی ناقلهای بیان کننده:
- در شرایط استریل از باکتری E.coli. حاوی ناقل PET28a برداشت کرده و در 2 میلی لیتر از محیط نوترین برات حاوی Ng/ml کانامایسین کشت میدهیم. بهمین ترتیب از باکتری E.coli. حاوی ناقل PGEX4T1 نیز برداشت کرده و در 2 میلی لیتر از محیط نوترین برات حاوی Ng/ml50 آمپی سیلین کشت میدهیم. سپس باکتریها را در الکوباتور شیکردار 0C37 بمدت 18 ساعت قرار میدهیم.
- به روشی که برای تخلیص پلاسمید ذکر شد، ناقلها را تخلیص می کنیم.
- هضم آنزیمی ناقلهای فوق را با استفادهع از آنزیمهای BamHI و xhoI بروش زیر انجام میدهیم
PET 28a 5ml PGEX4T1 5ml
BamHI 1ml BamHI 1ml
XhoI 1ml xhoI 1ml
Baffer(ytango) 4ml Baffer(ytango) 4ml
DDW 9ml DDW 9ml
Total 20 total 20
- پس از مخلوط کردن، نمونه ها را بمدت 2 ساعت در 0C37 قرار میدهیم.
3- اتصال دو قطعه DNA به یکدیگر:
برای اتصال ژن L7/L12 با ناقل PET28a و ژن P39 با ناقل PGEX41T1 از آنزیم T4 DNA ligase استفاده میشود.
PET 28a 1m1 PGEX4T1 1m
L7/L12 6ml p39 6ml
T4 DNA ligale 1ml T4 DNA ligale 1ml
Baffer 1ml Baffer 1.5ml
DDW 3.5ml DDW 3.5ml
Total 15ml total 15ml
سپس نمونه های فوق را بمدت 16 ساعت در دمای 0C14 قرار میدهیم.
14- انتقال DNA نوترکیب به میزان ) E.coli.(DH5
برای انتقال DNA نوترکیب به میزان ) E.coli.(DH5 از سلولهای Competetnt میزبان فوق که قبلاً تهیه شده بود، استفاده گردید. روش انتقال DNA نوترکیب قبلاً شرح داده شد.
5- غربالگری:
پس از انجام مرحله ترنسفورماسیون حاوی DNA نوترکیب را غربال می کنیم روش غربالگری قبلاً در همین فصل شرح داده شده است.
3- تولید و تخلیص پرئتئینهای L7/L12 و P39
همانطور که قبلاً ذکر شد پروتئینهای نوترکیب L7/L12 و P39 در سویه هایی از E.coli انجام گرفته است که حداقل تولید پروتئازها را دارند. بهمین دلیل برای تولید پروتئین L7/L12 از میزبان E.coli BL21(DE3)plyss و برای تولید پروتئین P39 از میزبان E.coli Bl21 استفاده دشه است. مراحل تولید پروتئین های فوق به شرح زیر است.
1- تهیه Competent cell از باکتریهای E.coli B121(DE3) PLySS (مقاوم به کارآمفنیکل) و E.coli BL21 : برای تهیه این سلو.ل از روشی که قبلاً در همین بخش ذکر شده، استفاده گردیده است.
2- تخلیص پلاسمیدهای L7/L12 PET 28a-و P39 PGEX4T1- از میزبان
) E.coli.(DH5: تخلیص پلاسمیدهای فوق با استفاده از روشی که توضیح داده شده، انجام گرفته است.
3- انتقال پلاسمیدهای فوق به میزبانهای ذکر شده در بند 1: ترانسفورماسیون پلاسمیدهای فوق در میزبانها مطابق روشی است که قبلاً ذکر شده است.
4- القاء: 5- آنالیز محصول القاء SDS PAGE
بیان پروتئینهای نوترکیب، با انتقال ناقل نوترکیب به سلول میزبان و رشد سلولهای ومیزبان و القاء تولید پروتئین صورت میگیرد.
پروموتورهای استفاده شده در مهندسی ژنتیکی دو دسته هستند.
دسته اول پروموتورهای دائمی که همواره فعال بوده و پروتئین نوترکیب را تولید می کنند و دسته دوم پروموتورهای القایی که در زمانی فعال خواهند بود که مهار از روی آنها برداشته شود.
القاء بیان پروتئین نوترکیب در ناقلهای PET28a و PGEX4T1 با استفاده از پروموتورهای القایی بوده که تحت کنترل اپراتور Lac هستند. بدین ترتیب که با افزودن ترکیب IPIG (isoprogyl - B-D-Thiogalctoside) القاء و تولید پروتئین صورت میگیرد. بدین ترتیب که IPTG به پروتئین سرکوب کننده اپراتور Lac متصل شده، آنرا غیرفعال میسازد. پس از آن RNA پلی مرازهای سلولی ترادف نوکلئوتیدی پائین دست است پروموتور را شناسایی کرده و رونویسی آغاز میگردد. سپس mRNA رونویسی شده به پروتئین نوترکیب توجه میگردد.
مواد لازم برای القاء:
- محیط کشت نوترین برات
- آنتی بیوتیکهای کانامایسین و آمپی سیلین
- محلول یک مولار IPTG
روش کار:
1- ابتدا در 2 میلی لیتر از محلول نوترین برات حاوی آنتی بیوتیکهای کانامایسین و کارآمفنیکل از E,cili BL21(DE3) Plyss حاوی
L7/L12 PET 28a- و در 2 میلی لیتر از محیط نوترین برات حاوی آمپی سیلین E.coli BL21 حاوی PGWX4T1-P39 کشت میدهیم. سپس بمدت 18 ساعت در گرمخانه 0C37 برروی شیکر قرار میدهیم.
2- در دو ارلن یک لیتری مجزا (یک الرلن دارای کانامایسین و کلرآمفنیکل و دیگری حاوی آمپی سیلین) از کشتهای فوق تلقیح می نمائیم. ارلن ها را در گرمخانه 0C37 برروی شیکر قرار میدهیم – دور شیکر باید حداقل rpm170 باشد.
3- در این مرحله پس از اینکه کشت سلوطل در DD600 بمقدار 6/0 رسید و قبل از القاء یک نمونه (در حدود 5/1 میلی لیتر) از محیط کشت برداشت کرده و رسوب سلولی آنرا با سانتریفوژ (8000 دور بمدت 5 دقیقه) بدست می آوریم. این رسوب سلولی را نمونه قبل از القاء نامگذاری می کنیم (Before induction=BI) و در 0C20- نگهداری می شود.
4- القاء بیان ژن را با اضافه کردن IPIG انجام میدهیم بطوریکه غلظت نهایی آن در کشت سلولی به یک میلی مولار برسد.
5- برای مدت 4 تا 5 ساعت کشت سلولها در دمای 0C37 روی شیکر قر ار می دهیم این زمان برای القاء و همچنین حداکثر بیان پروتئین نوترکیب لازم است.
6- پس از این زمان، نمونه دوم (در حد 5/1 میلی لیتر) برداشته و آنرا بعنوان نمونه بعد از القاء درنظر میگیریم. رسوب آنرا تهیه کرده و در 0C20- نگهداری می کنیم.
7- بقیه نمونه های بعد از القاء را سانتریفوژ (30 دقیقه در rpm4000) کرده و رسوب را برای تخلیص پروتئینها در 0C70- نگهداری می نمائیم.
5- آنالیز محصول بعد از القاء با SDS PAGE
برای بررسی نتیجه القاء نمونه های قبل از القاء و بعد از القاء باید بوسیله ژل الکتروفورز SDS PAGE بررسی نمائیم.
مواد و وسایل لازم برای SDS PAGE
1- تهیه ژل 15%
2- بافر x5 (هنگام استفاده به بافر x1 رقیق شود.)
3- تانک الکتروفورز
4- منبع نیرو
5- Loading buffer
6- رنگ آمیزی ژل DSD PSGE
7- تهیه ژل 15%
برای تهیه ژل 15% به مواد زیر نیاز داریم
1- آکریل آمید – بیس Acrl 30% bis 0.8%
آکریل آمید 30 گرم
بیس 8/0 گرم
ایندو را با هم مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم 100 میلی لیتر میرسیانیم و و محلول را در شیشه های تیره در 4 درجه سانتیگراد نگه میداریم.
2- تریس هیدروکلراید PH 8.8 Tris.cl/SDS PH 8.8
تریس Tris base 1/9 گرم
آب مقطر 30 میلی لیتر
PH این محلول را به 8/8 می رسانیم و سپس با استفاده از آب مقطر حجم آنرا به 50 میلی لیتر میرسانیم، سپس مقدار 2/0 گرم سدیم دودسیل سولفتات (SDS) به آن می افزائیم.
3- تریس هیدروکلراید PH 6.8 tris.cl/SDS PH 6.8
تریس 05/6 گرم
آب مقطر 40 میلی گرم
ابتدا ایندو را مخلوط کرده و PH آنرا به 8/6 میرسانیم سپس با آب مقطر حجم آنرا به 100 میلی لیتر رسانده و مقدار 4/0 گرم دودسیل سولفات (SDS) به آن افزوده در 0C4 نگداری می کنیم.
3- آمونیم پرسولفات 10% Ammunium persulfate 10%
آمونیم پرسولفات 1 گرم
آب مقطر 10 میلی لیتر
4- بافر الکتروفورز x5
تریس Tris base 15 گرم
گلیسین 12 گرم
سدیم دودسیل سولفات 5 گرم
حجم را با استفاده از آب مقطر به 1000 میلی لیتر می رسانیم.
روش کار تهیه ژل SDS PAGE
ابتدا صفحات شیشه ای و اسپیسرها را با الکل تمیز می کنیم. اسپیسرها در کناره های جانبی دو شیشه قرار داده و با گیره بخوبی محکم می کنیم سپس بوسیله آگار یک درصد انتهای دو شیشه را به بطور عمودی هستند را بخوبی مسدود می کنیم. پس از تهیه محلول Resolving به آرامی با استفاده از یک پیپت یا ستور از یک گوشه شیشه و در حد فاصل دو شیشه محلول Resolving را میریزیم و حدود باقیمانده از بالای شیشه را برای ریختن محلول Stacking خالی نگه میداریم. بلافاصله برروی محلول Resolving آب یا ایزوبوتانل ریخته تا از مجاورت با اکسیژن دور بماند. پس از اینکه ژل Resolving بخوبی بست، ایزوبوتانل را خالی کرده سطح ژل آب مقطر شسته و آنرا با کاغذ صافی خشک می کنیم. بعد از آن محلول Stacking را افزوده و شانه را که از قبل با الکل شسته شده است در حد فاصل دو شیشع درون محلول staking قرار میدهیم. پس از اینکه Staking نیز بصورت ژل درآمد، صفحات شیشه ای حاوی ژل را در داخل تانک حاوی بافر 1x قرار داده و شانه را به آرامی خارج میکنیم. در چاهکهای ایجاد شده نمونه های آماده شده (جوئشانده در Liading buffer) را اضافه کرده، تانک را به منبع نیرو و مل نموده و دستگاه را روی ولتاژ مناسب تنظیم می کنیم. پس از گذشت زمان لازم که براساس ولتاژ و اندازه ژل متفاوت است، باندهای پروتئینی برروی ژل تفکیک میشود. برای مشخص شدن باندها را رنگ آمیزی میکنیم.
DS gel – loading buffer
Tris.cl pH 6.8 50mm
Dithiotheritol 100mm
SDS 2%
Bromophenol 10.%
Glycerol 10%
- رنگ آمیزی ژلهای الکتروفورز SDS PAGE
معمولاً دو روش رنگ آمیزی استفاده میشود:
رنگ آمیزی نقره و رنگ آمیزی کماسی
رنگ آمیزی نقره زمان بیشتری را به خود اختصاص داده اما روشی حساس است که میتواند غلظت پروتئین 1 تا 5 نانوگرم را مشخص نماید.
روش کماسی سریعتر و ساده تر است ولی حساسیت آن کنتر از رنگ آمیزی نقره است و حدود 40 تا 50 نانوگرم حساسیت دارد.
در این پایان نامه از روش کماسی استفاده شده است.
مواد لازم برای رنگ آمیزی کماسی
1- محلول کماسی
فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد
تعداد صفحات این مقاله 63صفحه
پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید
دانلود مقاله بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac